微生物发酵法生产β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸一钠盐（NADPH钠盐，与NADPH功能一致）的核心是通过代谢工程改造微生物细胞，增强NADPH的合成能力并减少其消耗，最终实现目标产物的高效积累。其代谢工程策略可围绕强化合成途径、优化辅酶再生、平衡碳流分配及减少副产物消耗四个维度展开，具体如下：
一、强化NADPH的核心合成途径
NADPH在微生物中主要通过磷酸戊糖途径（PPP）、苹果酸酶催化反应及异柠檬酸脱氢酶途径生成，其中PPP是主要的来源。针对这一途径的强化是提升NADPH产量的关键：
过表达磷酸戊糖途径的关键酶
限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGD）是PPP途径中 NADPH 生成的核心催化剂。通过基因工程手段（如强启动子驱动、多拷贝整合）过表达这两种酶，可直接提升NADPH的合成速率，例如，在大肠杆菌中过表达源自酿酒酵母的G6PD基因（zwf1），可使胞内NADPH浓度提升20%-30%。
同时，敲除或弱化PPP途径中的竞争分支酶（如转酮酶、转醛酶），减少碳骨架向糖酵解途径的分流，可将更多葡萄糖-6-磷酸导入氧化阶段，优先用于NADPH合成。
激活辅助合成途径
苹果酸酶（ME）催化苹果酸脱氢生成丙酮酸时伴随NADPH生成，在胞内NADPH需求激增时可作为补充途径。通过过表达ME基因（如大肠杆菌的maeB），并优化三羧酸循环（TCA）中苹果酸的供应（如强化丙酮酸羧化酶活性以增加草酰乙酸），可增强辅助途径的贡献。
异柠檬酸脱氢酶（ICDH）在TCA循环中催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸，同时生成NADPH。通过改造ICDH的辅酶偏好性（如将依赖NAD?的酶改造为依赖NADP?），可提升其对NADPH合成的贡献。
二、优化 NADPH 再生的辅酶平衡
NADPH 的生成依赖 NADP?的再生（即 NADP?→NADPH 的循环），而 NADP?的再生与细胞内氧化还原状态密切相关。通过调控辅酶转化途径，可维持NADP?的充足供应，避免其成为NADPH合成的瓶颈：
强化NADP?的再生循环：NADPH 在参与还原反应后转化为NADP?，而NADP?的再生还可通过 NADH与NADP?的转氢反应实现（如膜结合转氢酶PntAB催化NADH+NADP?→NAD?+NADPH）。过表达PntAB或可溶性转氢酶UdhA，可促进 NADH 向 NADPH 的转化，间接提升 NADP?的利用率。
减少NADPH向NADH的无效转化：敲除或抑制消耗NADPH的冗余酶（如某些依赖NADPH的还原酶），避免NADPH被非目标反应消耗，维持其与NADP?的动态平衡。
三、平衡碳源分配与能量供应
NADPH的合成依赖碳源（如葡萄糖）的代谢通量，需协调碳流在合成途径与能量供应之间的分配，避免因能量不足限制合成效率：
优化碳源摄取与代谢：通过过表达葡萄糖转运蛋白（如大肠杆菌的ptsG）或解除碳代谢物阻遏（如敲除crp基因），增强细胞对碳源的摄取速率，为PPP途径提供充足底物（葡萄糖-6-磷酸）。
协调ATP与NADPH的生成：NADPH合成需消耗能量（如PPP途径的氧化阶段伴随ATP间接生成），通过弱化TCA循环中ATP生成的冗余步骤（如减少琥珀酸脱氢酶活性），可将更多碳流导向NADPH合成，同时避免ATP过剩对代谢的抑制。
四、抑制NADPH的消耗途径
微生物胞内NADPH常用于脂肪酸合成、氨基酸合成（如脯氨酸、丝氨酸）及抗氧化防御（如谷胱甘肽还原）等过程，若这些途径过度活跃，会显著降低NADPH的积累效率。通过代谢工程抑制消耗途径，可提高目标产物的产率：
敲除或弱化竞争性合成途径：例如，敲除脂肪酸合成的关键酶（如乙酰-CoA羧化酶）或某些氨基酸合成的限速酶（如脯氨酸脱氢酶），减少NADPH在生物合成中的消耗。
调控抗氧化系统的冗余活性：谷胱甘肽还原酶（GR）依赖NADPH将氧化型谷胱甘肽（GSSG）还原为还原型（GSH），若细胞氧化压力较低，可适度下调GR表达，减少NADPH用于抗氧化的消耗。
五、宿主菌株的适应性改造
选择合适的宿主菌株（如大肠杆菌、酿酒酵母、谷氨酸棒杆菌）并进行适应性进化，可增强其对高浓度NADPH的耐受能力及合成稳定性：
适应性实验室进化（ALE）：通过连续传代培养，在含有NADPH类似物或氧化压力的环境中筛选突变株，获得对NADPH积累更耐受的菌株，其基因组中可能积累增强合成或减少消耗的突变（如G6PD的组成型激活突变）。
基因组编辑优化：利用CRISPR-Cas9等工具对宿主基因组进行多靶点编辑，协同强化合成途径、弱化消耗途径及优化辅酶平衡，实现代谢网络的全局优化。
微生物发酵生产β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸一钠盐的代谢工程策略，本质是通过精准调控碳代谢流和辅酶平衡，构建“合成增强-消耗减少-再生高效”的细胞工厂。未来结合系统生物学建模（如通量平衡分析 FBA）和动态调控技术（如诱导型启动子），可进一步提升生产效率，推动产业化应用。
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